【《简牍探中华》独家呈现！“扁鹊医书”2000多年来首次数字复现】
2012年，四川省成都市金牛区天回镇出土近千枚汉代竹简，因其内容主要是医书，故被命名为“天回医简”。研究人员在整理这批医简的过程中，发现六枚载有“敝昔曰”的竹简，“敝昔”是谁，他的讲述为何在天回医简中多次出现？5月5日20:00档，《简牍探中华》将在总台央视综合频道（CCTV-1）播出，节目将重现天回医简里的故事场景，带领观众一探中华传统医学的发展历程，感受中华医者“极微极精，以观死生”的审慎态度与仁爱之心。
失传千年的扁鹊医书重见天日
“敝昔”是传说中的神医扁鹊
作为四川地区首次发现的竹简类文物，天回医简是迄今为止内容最丰富、最能系统反映秦汉时期医学面貌的出土医学文献。除部分文书散简和律令遗文外，这批医简主要包含八种医书，涉及经脉、脏腑、腧穴等医学内容。经研究者论证，基本可以论定医简中反复提及的“敝昔”便是传说中的“神医”扁鹊，而天回医简极有可能是失传两千多年的扁鹊医书。本期节目的文化访谈部分，主持人龙洋将与中央民族大学历史文化学院教授蒙曼、中国中医科学院中国医史文献研究所研究员顾漫、中国秦汉史研究会秘书长张欣，共同解读天回医简中蕴藏的精妙智慧，令观众能够在细微处感知中医文化的博大精深。从春秋时期开始，不断有名医被冠以“扁鹊”之名，《史记·扁鹊仓公列传》中记载的扁鹊最为人所熟知，主要指的是战国时期名叫“秦越人”的良医。他医术高超，是中华历史上第一位被载入正史的医家，也是中医学的奠基人，由其总结出的“色脉合参诊法”被后世发展为“望、闻、问、切”中医四诊。天回医简中关于“五色脉诊”的内容，正是扁鹊医学最突出的标志。
何谓“五色脉诊”？节目现场，中国中医科学院中国医史文献研究所研究员顾漫结合天回医简《逆顺五色脉臧验精神》简18记载的“心气者赤，肺气者白，肝气者青，胃气者黄，肾气者黑”，阐述了“五色诊”：“它把赤、白、青、黄、黑五种颜色与五脏对应，认为五脏之气可以外显在面部或者经络的特定部位，比如‘面黄肌瘦’往往是脾胃虚弱的表现。古人的行医经验在今天的临床上还可以得到应用，这是非常了不起的！”天回医简内容丰富、体系完整，兼具理论和临床价值，有力印证了中医药文化突出的连续性。
天回医简数据库首次发布
数字技术让千年简牍“青春永驻”
在辽阔的中华大地上，无数文化瑰宝熠熠生辉，天回医简不仅是弥足珍贵的文化遗产，也是鲜活生动的历史见证。据专家介绍，天回医简中存在较多战国秦汉时期山东地区“齐语”的特征，学界由此推断天回医简很有可能成书并抄录于齐，西汉文帝以后才流传至四川。因此，天回医简的破译，也成为两千多年前蜀地与齐鲁之间医学交流的有力物证。新一期节目实景戏剧将立足于此，聚焦呈现“心，病之正，极微极精，以观死生，可十全”的医者仁心，演员曹磊、安悦溪、孙维民等演绎西汉初期医者“弓”携医书入蜀地传医授道的故事，重现汉代中医药学术的辉煌，探寻中国传统医学的源流发展。
出土文献的重大发现推动学术发展，同时随着科技的不断进步，数字化也在古籍文物的保护、传承和研究中发挥着重要作用。2018年，在中国中医科学院中国医史文献研究所等单位工作的基础上，成都中医药大学中国出土医学文献与文物研究院首次以天回医简为代表，开展出土医学简牍的数字化整理。历经数年努力，成都中医药大学党委书记刘毅、天回医简整理组组长柳长华将在《简牍探中华》节目中，首次发布天回医简数据库的最新研究成果。本次天回医简数据库的建立，是医学简牍整理史上第一次以数字化的方式制作简文摹本，将让千年简牍“青春永驻”，使简牍研究更加具象可感。
尘封千年的天回医简如何为观众再现汉代中医药文化之盛，展示中华医学的博大智慧？5月5日，总台央视综合频道（CCTV-1）20:00档，《简牍探中华》第五期邀你开启一场跨越时空的探寻之旅！
2012年，四川省成都市金牛区天回镇出土近千枚汉代竹简，因其内容主要是医书，故被命名为“天回医简”。研究人员在整理这批医简的过程中，发现六枚载有“敝昔曰”的竹简，“敝昔”是谁，他的讲述为何在天回医简中多次出现？5月5日20:00档，《简牍探中华》将在总台央视综合频道（CCTV-1）播出，节目将重现天回医简里的故事场景，带领观众一探中华传统医学的发展历程，感受中华医者“极微极精，以观死生”的审慎态度与仁爱之心。
失传千年的扁鹊医书重见天日
“敝昔”是传说中的神医扁鹊
作为四川地区首次发现的竹简类文物，天回医简是迄今为止内容最丰富、最能系统反映秦汉时期医学面貌的出土医学文献。除部分文书散简和律令遗文外，这批医简主要包含八种医书，涉及经脉、脏腑、腧穴等医学内容。经研究者论证，基本可以论定医简中反复提及的“敝昔”便是传说中的“神医”扁鹊，而天回医简极有可能是失传两千多年的扁鹊医书。本期节目的文化访谈部分，主持人龙洋将与中央民族大学历史文化学院教授蒙曼、中国中医科学院中国医史文献研究所研究员顾漫、中国秦汉史研究会秘书长张欣，共同解读天回医简中蕴藏的精妙智慧，令观众能够在细微处感知中医文化的博大精深。从春秋时期开始，不断有名医被冠以“扁鹊”之名，《史记·扁鹊仓公列传》中记载的扁鹊最为人所熟知，主要指的是战国时期名叫“秦越人”的良医。他医术高超，是中华历史上第一位被载入正史的医家，也是中医学的奠基人，由其总结出的“色脉合参诊法”被后世发展为“望、闻、问、切”中医四诊。天回医简中关于“五色脉诊”的内容，正是扁鹊医学最突出的标志。
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天回医简数据库首次发布
数字技术让千年简牍“青春永驻”
在辽阔的中华大地上，无数文化瑰宝熠熠生辉，天回医简不仅是弥足珍贵的文化遗产，也是鲜活生动的历史见证。据专家介绍，天回医简中存在较多战国秦汉时期山东地区“齐语”的特征，学界由此推断天回医简很有可能成书并抄录于齐，西汉文帝以后才流传至四川。因此，天回医简的破译，也成为两千多年前蜀地与齐鲁之间医学交流的有力物证。新一期节目实景戏剧将立足于此，聚焦呈现“心，病之正，极微极精，以观死生，可十全”的医者仁心，演员曹磊、安悦溪、孙维民等演绎西汉初期医者“弓”携医书入蜀地传医授道的故事，重现汉代中医药学术的辉煌，探寻中国传统医学的源流发展。
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聚焦高质量就业丨海帆职场多位同学在核心期刊发表论文
近日，海帆职场的同学们传来喜讯，他们在国内外的核心期刊上发表了多篇学术论文。这些同学分别来自不同专业背景，包括经济、管理、生物、医学、材料、化工等多个领域，论文涵盖多种前沿领域的研究，包括人工智能、大数据分析、生物医学工程、金融风险管理、跨境电商运营等。
这些论文的发表，既充分展现了同学们的学术实力和研究能力，又为未来的研究生推免、考研面试、留学申请、国企求职等打下了良好的履历基础。
海帆职场一直秉承“学以致用”的人才培养理念，注重培养学员的解决问题的能力和创新精神。这些同学的成功经验不仅证明了海帆职场人才培养模式的有效性，也为其他同学树立了榜样，激励他们不断提升自己的学术水平和实践能力。
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走近科学前沿：生信分析和外膜囊泡为何引人瞩目？
本期为大家介绍一篇来自《Journal of Hazardous Materials》（IF=13.6）的文章，“Unveiling a novel mechanism for competitive advantage of ciprofloxacin-resistant bacteria in the environment through bacterial membrane vesicles”，涉及细菌外膜囊泡，为揭示细菌的耐药性以及在环境中的适应性生长和传播提供了全新的思路。
本文的主要内容是揭示了环境中耐环丙沙星细菌竞争优势的一个新机制，即通过细菌膜囊泡（BMVs）进行传递。研究发现，耐环丙沙星细菌产生的BMVs比敏感菌株产生的BMVs具有更丰富的蛋白质组成，并且这些差异表达的蛋白质主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和RNA降解等途径。进一步研究发现，耐环丙沙星细菌的BMVs能够与敏感菌株发生直接互作用，导致敏感菌株的破坏和内容物泄漏。
此外，研究还发现耐环丙沙星细菌的BMVs通过酸化敏感菌株的细胞内环境和调节细胞膜电位来增强对敏感菌株的抑制作用。研究结果揭示了耐药菌株通过BMVs传递的竞争优势机制，以及BMVs中的EcnB和酸性代谢产物在这一过程中的重要作用。
本文通过连续在低浓度头孢曲松（CIP）中培养，研究了CIP抗性大肠杆菌（CIP r）与敏感大肠杆菌（SEN）的竞争优势，使用共聚焦荧光显微镜、透射电子显微镜（TEM）等技术分析了CIP r产生的细菌膜泡（BMVs）对SEN的影响，然后通过蛋白质组学分析发现了与CIP抗性相关的关键蛋白质，如EcnB、AnsB、AldA、HslV、PurE和CopA，再研究了EcnB在CIP r中的作用以及其在CIP r -BMVs中的表达和代谢组学分析找到了CIP r -BMVs中具有抑制SEN作用的酸性代谢物。
这些实验揭示了CIP r在环境中的竞争优势及其与BMVs的关系，以及EcnB和酸性代谢物在CIP r -BMVs中的作用，为深入理解药物抗性及其在不同环境中的传播提供了新的认识。
CIPr（环丙沙星耐药菌）大肠杆菌比敏感性大肠杆菌（SEN:环丙沙星敏感菌）在竞争中更具有优势
为了模拟ARB在环境中低浓度抗生素条件下的形成，将SEN在亚MIC CIP存在的情况下连续传代，导致MIC增加了163倍，并产生了CIPr。生长曲线分析表明，与SEN相比，CIPr在稳定期的生长速度更慢，最终密度更低，这表明对长期CIP暴露产生了适应性（图 1A）。SEN的亚抑制浓度未达到最低限度杀菌浓度 （MBC），使 SEN 和耐药菌株共存一段时间。我们的竞争试验表明，CIPr菌株与SEN相比具有竞争优势（图1A）。
图 1 CIPr与SEN相比具有竞争优势。
BMV 赋予耐药细菌以竞争优势
在探索竞争机制时，作者发现来自 CIPr 培养的上清液（CIPr-SQ）能溶解 SEN 并抑制其生长，而来自 SEN 培养的上清液（SEN-SQ）则没有这种作用（图 1B）。作者重点研究了它们对 CIPr 抑制效果的影响。与 SEN 相比，CIPr 有更高浓度但更小直径的 BMVs（图 1C-F），这可能是适应长期抗生素压力的结果。随后的透射电镜（TEM）分析确认了大多数 BMVs 的直径大约在 15 到 150 纳米之间（图 1）。
向 SEN 培养物中添加 CIPr-BMVs 导致溶解和生长抑制，呈剂量依赖性（图 1G），而将 CIPr-BMVs 添加到 CIPr 或 SEN-BMVs 添加到任一菌株中均未显示出此类效果（图 1C-E）。此外，从多粘菌素抗性细菌中提取的 BMVs 也观察到了对 SEN 的类似抑制效果（图1F）。
这些发现表明 CIPr-BMVs 对 SEN 施加了细菌溶解作用，为 CIPr 提供了竞争优势。与其他已知传递抗性基因的 BMVs 不同，CIPr-BMVs 并未增加 SEN 的最小抑菌浓度（MIC），反而降低了其在 CIP 压力下的生存能力（图 1H）。以上结果表明，CIPr 的竞争优势不是由于 SEN 抗性增加，而是由于直接的细菌溶解作用。共聚焦荧光显微镜显示，DID标记的CIPr-BMVs或SEN-BMVs可以与DAPI标记的SEN融合（图2A），TEM分析进一步支持了CIPr的细菌溶解作用-BMVs 上
SEN，如膜破坏和内容物泄漏所观察到的（图 2B-C）。
图2 CIPr的-BMV 对 SEN 具有细菌溶解作用
BMV中的膜蛋白主要有助于竞争CIP的优势
为了进一步探索 CIPr-BMVs 成分对竞争的潜在影响，作者通过热处理 CIPr-BMVs 以失活其大部分成分。值得注意的是，100°C的热处理导致颗粒大小增加，浓度减少，并且失去了对 SEN 的致死效果（图 3A, D, H, I）。这表明负责竞争优势的关键分子对热失活敏感。此外，对 CIPr-BMVs 进行超声处理也导致了同样的结果（图 3B, E, H, I），表明 BMVs 的结构完整性在其功能中起着关键作用。
在随后的蛋白酶 K 消化实验中，作者观察到 CIPr-BMVs 对 SEN 的致死效果消失，这一效果通过添加蛋白酶 K 抑制剂部分恢复。而蛋白酶 K 和蛋白酶抑制剂本身不影响 BMVs 的颗粒大小和浓度（图 3C, F-I）。由于蛋白酶 K 能够降解表面蛋白而不破坏 BMVs 的膜结构，作者假设 CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制可能归因于 CIPr-BMVs 膜表面蛋白的存在。
图3 不同处理下的CIPr-BMVs对SEN的抑制作用
蛋白质组学分析可识别 CIP 耐药性的关键蛋白
基于数据独立获取（DIA）的定量蛋白质组学方法被用于阐明 SEN-BMVs 和 CIPr-BMVs 的蛋白质组成。这一分析显示 CIPr-BMVs 相较于 SEN-BMVs 有更多样的蛋白质谱，CIPr-BMVs 中鉴定到 1420 种蛋白质，而 SEN-BMVs 中为 624 种。
功率律全局误差模型（PLGEM）分析确认了作者蛋白质组数据的可靠性，皮尔森相关系数为 0.82，调整后的 r2 值为 0.977（图 2A-D）。比较两种 BMVs 类型共有的 561 种蛋白质，鉴定出 354 种差异表达蛋白质（DEPs），其中 159 种在 CIPr-BMVs 中上调，195 种下调（图 4A）。这些 DEPs 主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和 RNA 降解途径，根据 KEGG 分析（图 4B）。值得注意的是，33 种外膜蛋白差异表达，与在 CIPr 中观察到的 BMVs 增加产量一致（图 4C）。标记蛋白 FepA、LpoA、OmpA 和 BamA 的高丰度表明作者获得的 BMVs 高纯度。
为了深入探索 BMVs 蛋白与 CIP 抗性之间的关系，作者选择了 L-天冬酰胺酶（AnsB，上调 18.62 倍）和鸟氨酸氨甲酰转移酶亚基 F（ArgF，下调 117 倍）作为分别代表前十大上调和下调蛋白进行敲除验证（图 4D）。此外，利用 Cytohubba-DMNC（最大邻域组分密度），作者识别出乳醛脱氢酶（AldA，上调 8.25 倍）作为在排除与核糖体相关蛋白后差异蛋白 String 网络中排名最高的蛋白（图 4E）。最小抑制浓度（MIC）测试显示，上调蛋白 AldA 和 AnsB 的删除增加了 SEN 对 CIP 的敏感性（图 2E-F, 图 4F），而下调蛋白 ArgF 的删除则不影响对 CIP 的抗性（图 4F）。
图4 SEN-BMVs和CIPr-BMVs的蛋白质组学分析
在 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 中也注意到了独特的蛋白，CIPr-BMVs 展示了 859 种独特蛋白而 SEN-BMVs 有 63 种（图 5A），可能影响细菌竞争或对 CIP 抗性作出贡献。基因本体（GO）分析突出了 RNA 修改，特别是 RNA 甲基化的显著富集，包括 ncRNA 甲基化、rRNA 甲基化和 tRNA 甲基化（图 5B-C）。此外，针对编码 CIPr-BMVs 或 SEN-BMVs 独特蛋白的基因，包括 EcnB、HslV、PurE、CopA 和 YdhV，构建了敲除菌株。随后的 MIC 测量指出，与 SEN 相比，ΔhslV 和 ΔpurE 菌株显示对 CIP 的抗性降低，而 ΔcopA 表现出增加的抗性。在删除 ΔecnB 和 ΔydhV 基因的菌株中未观察到显著变化（图 5D）。
图5 通过分析 CIPr-BMV 或 SEN-BMV 中的独特蛋白质来鉴定 CIP 耐药相关蛋白和通路
EcnB 是 CIPr 中的关键竞争分子
在作者对 CIPr-BMVs 中独特蛋白的分析中，EcnB 成为这些蛋白中最丰富的蛋白，引起了作者的注意（图 6A）。EcnB 是一种已知具有细菌溶解性质的膜定位蛋白。西方印迹分析确认 EcnB 存在于 CIPr 上清液中，但不在 SEN 中，并且显示 CIPr-BMVs 中的 EcnB 水平高于 SEN-BMVs（图 6B）。然而，在 SEN 和 CIPr 的 100 kDa 超滤管（LC）的流出液中未发现 EcnB。RT-qPCR 进一步揭示了在 CIPr 中 ecnB 在转录水平上的上调，以及其负调控因子 ompR 和 envZ 的同时下调（图 6C）。
作者通过生成敲除株 ΔecnB-CIPr 进一步研究了 EcnB 在 CIP-BMVs 中的作用。生长曲线显示，ecnB 的敲减并不影响细菌生长（图 1A）。有趣的是，ecnB 的删除并未改变菌株对 CIP 的最小抑制浓度（MIC）（图 6D），表明 EcnB 对维持细菌 CIP 抗性不是必需的。然而，在 CIP 的亚抑制浓度下连续 14 代传代后，ΔecnB-SEN 相比于 SEN 的抗性发展速率显著较慢，MIC 倍数变化分别为 27.5 和 106.7（图 6E）。
从 CIPr-BMVs 和 ΔecnB-CIPr-BMVs 的 Nanosight 分析中发现，ecnB 敲除并未影响囊泡大小，但显著降低了囊泡浓度（图 6F-I）。ΔecnB-CIPr-BMVs 对 SEN 生存的影响与 CIPr-BMVs 相比被消除（图 6J）。在共培养竞争实验中，ΔecnB-CIPr 株失去了其对 SEN 的竞争优势（图 6K）。这一发现在使用 SV-HUC-1 的模拟宿主环境中得到了进一步验证。在宿主环境中，通过在 CIPr 中敲除 ecnB，消除了 CIPr 相对于 SEN 的竞争优势（图 6L）。
图6 EcnB是一个关键的竞争因素
CIPr-BMVs中的酸性代谢物增强对敏感菌株的抑制作用
代谢组学分析被用于识别 CIPr-BMVs 中能增强 EcnB 对 SEN 溶解活性的成分。这项分析，通过显著的组间差异和高模型鲁棒性，识别出 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 之间独特的代谢物谱（图 3A-B）。通过 P 值 < 0.05 和在投影中的变量重要性（VIP）> 1 定义的差异代谢物揭示了顺式十一碳二烯酸作为一个主要成分，可能影响 CIPr-BMVs 内的 pH 环境或它们与其他菌株的相互作用（图 3C-D）。和弦图显示差异代谢物主要来源于脂类和类脂分子（图 3E）。分析主要在 CIPr-BMVs 中发现上调的酸性代谢物（图 7A, 表 S3），表明通过酸化 SEN 增强了 EcnB 的抗菌活性。途径分析指示甘油磷脂、甘油和不饱和脂肪酸代谢的上调（图 7B）。蛋白质组数据与这些发现一致，显示与脂肪酸合成和代谢相关的蛋白增加（图 7C-D），与之前关于 CIP 抗性中脂肪酸代谢的研究一致。
作者进一步研究了 CIPr-BMVs 对 SEN 的 pH 和膜电位的影响。结果显示，SEN 的 pH 值下降，且在暴露于 CIPr-BMVs 时膜电位显著去极化（图 7E-F）。此外，CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制效果在更酸性条件下增强，在更碱性环境中减弱（图 7G-H）。然而，这种效果在 ΔecnB-CIPr-BMVs 中未观察到，强调了 EcnB 在此过程中的作用（图 7I）。
图7 CIPr-BMVs酸化SEN
研究结论：
在没有抗生素压力的情况下，CIPr展示出比敏感大肠杆菌（SEN）更强的竞争优势。
细菌膜泡（BMVs）使CIPr具有竞争优势。
膜定位的Entericidin B（EcnB）在CIPr的竞争优势和抗药性形成中发挥关键作用。
酸性代谢物在CIPr -BMVs中起到增强抑制SEN的作用。
这些发现揭示了CIPr在环境中的适应性生长和传播机制，为全面理解抗药性机制、抗药菌的传播和竞争提供了新的视角。
总结
本研究旨在了解CIPr 和SEN之间的竞争动态及其机制，特别是BMVs在抗药性形成和细菌竞争中的作用。通过电子显微镜、蛋白质组学和代谢组学分析BMVs，揭示了CIPr具有竞争优势的潜在机制，特别关注膜定位的Entericidin B（EcnB）在抗药性形成和细菌竞争中的作用。这项研究取得了对CIPr在环境背景下的适应性生长和传播的理解的突破性进展。
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本期为大家介绍一篇来自《Journal of Hazardous Materials》（IF=13.6）的文章，“Unveiling a novel mechanism for competitive advantage of ciprofloxacin-resistant bacteria in the environment through bacterial membrane vesicles”，涉及细菌外膜囊泡，为揭示细菌的耐药性以及在环境中的适应性生长和传播提供了全新的思路。
本文的主要内容是揭示了环境中耐环丙沙星细菌竞争优势的一个新机制，即通过细菌膜囊泡（BMVs）进行传递。研究发现，耐环丙沙星细菌产生的BMVs比敏感菌株产生的BMVs具有更丰富的蛋白质组成，并且这些差异表达的蛋白质主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和RNA降解等途径。进一步研究发现，耐环丙沙星细菌的BMVs能够与敏感菌株发生直接互作用，导致敏感菌株的破坏和内容物泄漏。
此外，研究还发现耐环丙沙星细菌的BMVs通过酸化敏感菌株的细胞内环境和调节细胞膜电位来增强对敏感菌株的抑制作用。研究结果揭示了耐药菌株通过BMVs传递的竞争优势机制，以及BMVs中的EcnB和酸性代谢产物在这一过程中的重要作用。
本文通过连续在低浓度头孢曲松（CIP）中培养，研究了CIP抗性大肠杆菌（CIP r）与敏感大肠杆菌（SEN）的竞争优势，使用共聚焦荧光显微镜、透射电子显微镜（TEM）等技术分析了CIP r产生的细菌膜泡（BMVs）对SEN的影响，然后通过蛋白质组学分析发现了与CIP抗性相关的关键蛋白质，如EcnB、AnsB、AldA、HslV、PurE和CopA，再研究了EcnB在CIP r中的作用以及其在CIP r -BMVs中的表达和代谢组学分析找到了CIP r -BMVs中具有抑制SEN作用的酸性代谢物。
这些实验揭示了CIP r在环境中的竞争优势及其与BMVs的关系，以及EcnB和酸性代谢物在CIP r -BMVs中的作用，为深入理解药物抗性及其在不同环境中的传播提供了新的认识。
CIPr（环丙沙星耐药菌）大肠杆菌比敏感性大肠杆菌（SEN:环丙沙星敏感菌）在竞争中更具有优势
为了模拟ARB在环境中低浓度抗生素条件下的形成，将SEN在亚MIC CIP存在的情况下连续传代，导致MIC增加了163倍，并产生了CIPr。生长曲线分析表明，与SEN相比，CIPr在稳定期的生长速度更慢，最终密度更低，这表明对长期CIP暴露产生了适应性（图 1A）。SEN的亚抑制浓度未达到最低限度杀菌浓度 （MBC），使 SEN 和耐药菌株共存一段时间。我们的竞争试验表明，CIPr菌株与SEN相比具有竞争优势（图1A）。
图 1 CIPr与SEN相比具有竞争优势。
BMV 赋予耐药细菌以竞争优势
在探索竞争机制时，作者发现来自 CIPr 培养的上清液（CIPr-SQ）能溶解 SEN 并抑制其生长，而来自 SEN 培养的上清液（SEN-SQ）则没有这种作用（图 1B）。作者重点研究了它们对 CIPr 抑制效果的影响。与 SEN 相比，CIPr 有更高浓度但更小直径的 BMVs（图 1C-F），这可能是适应长期抗生素压力的结果。随后的透射电镜（TEM）分析确认了大多数 BMVs 的直径大约在 15 到 150 纳米之间（图 1）。
向 SEN 培养物中添加 CIPr-BMVs 导致溶解和生长抑制，呈剂量依赖性（图 1G），而将 CIPr-BMVs 添加到 CIPr 或 SEN-BMVs 添加到任一菌株中均未显示出此类效果（图 1C-E）。此外，从多粘菌素抗性细菌中提取的 BMVs 也观察到了对 SEN 的类似抑制效果（图1F）。
这些发现表明 CIPr-BMVs 对 SEN 施加了细菌溶解作用，为 CIPr 提供了竞争优势。与其他已知传递抗性基因的 BMVs 不同，CIPr-BMVs 并未增加 SEN 的最小抑菌浓度（MIC），反而降低了其在 CIP 压力下的生存能力（图 1H）。以上结果表明，CIPr 的竞争优势不是由于 SEN 抗性增加，而是由于直接的细菌溶解作用。共聚焦荧光显微镜显示，DID标记的CIPr-BMVs或SEN-BMVs可以与DAPI标记的SEN融合（图2A），TEM分析进一步支持了CIPr的细菌溶解作用-BMVs 上
SEN，如膜破坏和内容物泄漏所观察到的（图 2B-C）。
图2 CIPr的-BMV 对 SEN 具有细菌溶解作用
BMV中的膜蛋白主要有助于竞争CIP的优势
为了进一步探索 CIPr-BMVs 成分对竞争的潜在影响，作者通过热处理 CIPr-BMVs 以失活其大部分成分。值得注意的是，100°C的热处理导致颗粒大小增加，浓度减少，并且失去了对 SEN 的致死效果（图 3A, D, H, I）。这表明负责竞争优势的关键分子对热失活敏感。此外，对 CIPr-BMVs 进行超声处理也导致了同样的结果（图 3B, E, H, I），表明 BMVs 的结构完整性在其功能中起着关键作用。
在随后的蛋白酶 K 消化实验中，作者观察到 CIPr-BMVs 对 SEN 的致死效果消失，这一效果通过添加蛋白酶 K 抑制剂部分恢复。而蛋白酶 K 和蛋白酶抑制剂本身不影响 BMVs 的颗粒大小和浓度（图 3C, F-I）。由于蛋白酶 K 能够降解表面蛋白而不破坏 BMVs 的膜结构，作者假设 CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制可能归因于 CIPr-BMVs 膜表面蛋白的存在。
图3 不同处理下的CIPr-BMVs对SEN的抑制作用
蛋白质组学分析可识别 CIP 耐药性的关键蛋白
基于数据独立获取（DIA）的定量蛋白质组学方法被用于阐明 SEN-BMVs 和 CIPr-BMVs 的蛋白质组成。这一分析显示 CIPr-BMVs 相较于 SEN-BMVs 有更多样的蛋白质谱，CIPr-BMVs 中鉴定到 1420 种蛋白质，而 SEN-BMVs 中为 624 种。
功率律全局误差模型（PLGEM）分析确认了作者蛋白质组数据的可靠性，皮尔森相关系数为 0.82，调整后的 r2 值为 0.977（图 2A-D）。比较两种 BMVs 类型共有的 561 种蛋白质，鉴定出 354 种差异表达蛋白质（DEPs），其中 159 种在 CIPr-BMVs 中上调，195 种下调（图 4A）。这些 DEPs 主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和 RNA 降解途径，根据 KEGG 分析（图 4B）。值得注意的是，33 种外膜蛋白差异表达，与在 CIPr 中观察到的 BMVs 增加产量一致（图 4C）。标记蛋白 FepA、LpoA、OmpA 和 BamA 的高丰度表明作者获得的 BMVs 高纯度。
为了深入探索 BMVs 蛋白与 CIP 抗性之间的关系，作者选择了 L-天冬酰胺酶（AnsB，上调 18.62 倍）和鸟氨酸氨甲酰转移酶亚基 F（ArgF，下调 117 倍）作为分别代表前十大上调和下调蛋白进行敲除验证（图 4D）。此外，利用 Cytohubba-DMNC（最大邻域组分密度），作者识别出乳醛脱氢酶（AldA，上调 8.25 倍）作为在排除与核糖体相关蛋白后差异蛋白 String 网络中排名最高的蛋白（图 4E）。最小抑制浓度（MIC）测试显示，上调蛋白 AldA 和 AnsB 的删除增加了 SEN 对 CIP 的敏感性（图 2E-F, 图 4F），而下调蛋白 ArgF 的删除则不影响对 CIP 的抗性（图 4F）。
图4 SEN-BMVs和CIPr-BMVs的蛋白质组学分析
在 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 中也注意到了独特的蛋白，CIPr-BMVs 展示了 859 种独特蛋白而 SEN-BMVs 有 63 种（图 5A），可能影响细菌竞争或对 CIP 抗性作出贡献。基因本体（GO）分析突出了 RNA 修改，特别是 RNA 甲基化的显著富集，包括 ncRNA 甲基化、rRNA 甲基化和 tRNA 甲基化（图 5B-C）。此外，针对编码 CIPr-BMVs 或 SEN-BMVs 独特蛋白的基因，包括 EcnB、HslV、PurE、CopA 和 YdhV，构建了敲除菌株。随后的 MIC 测量指出，与 SEN 相比，ΔhslV 和 ΔpurE 菌株显示对 CIP 的抗性降低，而 ΔcopA 表现出增加的抗性。在删除 ΔecnB 和 ΔydhV 基因的菌株中未观察到显著变化（图 5D）。
图5 通过分析 CIPr-BMV 或 SEN-BMV 中的独特蛋白质来鉴定 CIP 耐药相关蛋白和通路
EcnB 是 CIPr 中的关键竞争分子
在作者对 CIPr-BMVs 中独特蛋白的分析中，EcnB 成为这些蛋白中最丰富的蛋白，引起了作者的注意（图 6A）。EcnB 是一种已知具有细菌溶解性质的膜定位蛋白。西方印迹分析确认 EcnB 存在于 CIPr 上清液中，但不在 SEN 中，并且显示 CIPr-BMVs 中的 EcnB 水平高于 SEN-BMVs（图 6B）。然而，在 SEN 和 CIPr 的 100 kDa 超滤管（LC）的流出液中未发现 EcnB。RT-qPCR 进一步揭示了在 CIPr 中 ecnB 在转录水平上的上调，以及其负调控因子 ompR 和 envZ 的同时下调（图 6C）。
作者通过生成敲除株 ΔecnB-CIPr 进一步研究了 EcnB 在 CIP-BMVs 中的作用。生长曲线显示，ecnB 的敲减并不影响细菌生长（图 1A）。有趣的是，ecnB 的删除并未改变菌株对 CIP 的最小抑制浓度（MIC）（图 6D），表明 EcnB 对维持细菌 CIP 抗性不是必需的。然而，在 CIP 的亚抑制浓度下连续 14 代传代后，ΔecnB-SEN 相比于 SEN 的抗性发展速率显著较慢，MIC 倍数变化分别为 27.5 和 106.7（图 6E）。
从 CIPr-BMVs 和 ΔecnB-CIPr-BMVs 的 Nanosight 分析中发现，ecnB 敲除并未影响囊泡大小，但显著降低了囊泡浓度（图 6F-I）。ΔecnB-CIPr-BMVs 对 SEN 生存的影响与 CIPr-BMVs 相比被消除（图 6J）。在共培养竞争实验中，ΔecnB-CIPr 株失去了其对 SEN 的竞争优势（图 6K）。这一发现在使用 SV-HUC-1 的模拟宿主环境中得到了进一步验证。在宿主环境中，通过在 CIPr 中敲除 ecnB，消除了 CIPr 相对于 SEN 的竞争优势（图 6L）。
图6 EcnB是一个关键的竞争因素
CIPr-BMVs中的酸性代谢物增强对敏感菌株的抑制作用
代谢组学分析被用于识别 CIPr-BMVs 中能增强 EcnB 对 SEN 溶解活性的成分。这项分析，通过显著的组间差异和高模型鲁棒性，识别出 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 之间独特的代谢物谱（图 3A-B）。通过 P 值 < 0.05 和在投影中的变量重要性（VIP）> 1 定义的差异代谢物揭示了顺式十一碳二烯酸作为一个主要成分，可能影响 CIPr-BMVs 内的 pH 环境或它们与其他菌株的相互作用（图 3C-D）。和弦图显示差异代谢物主要来源于脂类和类脂分子（图 3E）。分析主要在 CIPr-BMVs 中发现上调的酸性代谢物（图 7A, 表 S3），表明通过酸化 SEN 增强了 EcnB 的抗菌活性。途径分析指示甘油磷脂、甘油和不饱和脂肪酸代谢的上调（图 7B）。蛋白质组数据与这些发现一致，显示与脂肪酸合成和代谢相关的蛋白增加（图 7C-D），与之前关于 CIP 抗性中脂肪酸代谢的研究一致。
作者进一步研究了 CIPr-BMVs 对 SEN 的 pH 和膜电位的影响。结果显示，SEN 的 pH 值下降，且在暴露于 CIPr-BMVs 时膜电位显著去极化（图 7E-F）。此外，CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制效果在更酸性条件下增强，在更碱性环境中减弱（图 7G-H）。然而，这种效果在 ΔecnB-CIPr-BMVs 中未观察到，强调了 EcnB 在此过程中的作用（图 7I）。
图7 CIPr-BMVs酸化SEN
研究结论：
在没有抗生素压力的情况下，CIPr展示出比敏感大肠杆菌（SEN）更强的竞争优势。
细菌膜泡（BMVs）使CIPr具有竞争优势。
膜定位的Entericidin B（EcnB）在CIPr的竞争优势和抗药性形成中发挥关键作用。
酸性代谢物在CIPr -BMVs中起到增强抑制SEN的作用。
这些发现揭示了CIPr在环境中的适应性生长和传播机制，为全面理解抗药性机制、抗药菌的传播和竞争提供了新的视角。
总结
本研究旨在了解CIPr 和SEN之间的竞争动态及其机制，特别是BMVs在抗药性形成和细菌竞争中的作用。通过电子显微镜、蛋白质组学和代谢组学分析BMVs，揭示了CIPr具有竞争优势的潜在机制，特别关注膜定位的Entericidin B（EcnB）在抗药性形成和细菌竞争中的作用。这项研究取得了对CIPr在环境背景下的适应性生长和传播的理解的突破性进展。
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